El Californiano James Masters, se mudó a Los Ángeles para estudiar en el Conservatorio del Pacífico de las Artes Escénicas. Para aumentar su experiencia, acudió a otras dos universidades: el American Conservatory Theatre de San Francisco y la Universidad de Julliard en Nueva York.
En 1992, Marsters consiguió su primer papel televisivo en la serie 'Doctor en Alaska', antes de hacerse conocido para el gran público, a la edad de 34 años, gracias a 'Buffy Cazavampiros'. El actor daría vida a Spike, un carismático vampiro, durante las siete temporadas que duró la serie. También interpretó a este mismo personaje en el spin-off de la serie, 'Angel'.
Además de desarrollar su faceta como cantante y compositor, el actor se pasea por otras series como ' Smallville' o 'Torchwood'. También ha desarrollado su carrera interpretativa en cintas como 'Posdata: Te quiero' o 'Dragonball Evolution', donde interpretaba a Piccolo, el villano de la función.