De origen humilde, tuvo que sufrir la pobreza durante su infancia. Se matriculó en la Facultad de Medicina de la Universidad de Ciudad de México para complacer a su padre, pero durante los estudios comienza a realizar sus pinitos profesionales como bailarín e imitador.
Trabajó en el circo y pronto sus grandes dotes para la interpretación, su ternura y su visión optimista del mundo le llevaron a recrear el tipo de "pelao" (hombre vulgar y pobre de México) y de este modo nació "Cantinflas". Cierto día acudió a una cita con un empresario del teatro de variedades de Jalapa (Veracruz) para que lo viera bailar pero por un incidente ocurrido en el local Cantinflas tuvo que salir a escena y calmar los ánimos del público. Los nervios no le permitían hablar con fluidez y su forma entrecortada de charlar hizo reir al público. Así inició su carrera de cómico.
El mismísimo Charles Chaplin le admiraba e intentó hacer una película con él pero no fue posible. En 1940 fundó la productora Rosa Film junto a Jacques Gelman y Santiago Riachi. Su primer film lo rodó en 1936 aunque será cuatro años después cuando alcance la fama con la película "Ahí esta el detalle".
Quizás el éxito de Cantinflas residiese, más que en la calidad de sus películas, en la extraordinaria expresividad de su caracterización (pantalones caídos, camiseta haraposa, corbata atada al cuello...) y en la identificación plena de su personaje con los problemas sociales de la época y más concretamente con la realidad de las clases proletarias de América Latina.
Mario Moreno no se ciñó sólo al cine de habla hispana sino que también traspasó fronteras lingüísticas participando en producciones extranjeras como las películas inglesas "La vuelta al mundo en 80 días" y "Pepe". Fue miembro del Sindicato de Actores y al sustituir en la dirección de dicha institución a Jorge Negrete, fundó de forma benéfica la Casa del Actor. En 1952, haciendo gala de la generosidad que lo caracterizaba, emprendió una campaña a favor de los pobres para construir un habitat social. Vivió sus últimos años retirado en su rancho.