The Spot será uno de los villanos de la película. Sus poderes le permiten abrir nuevas dimensiones mediante las manchas de su cuerpo. En la versión original, el actor Jason Schwartzman será la voz de este personaje.
Según se ha confirmado, Spider-Noir volverá a aparecer en esta secuela. En la versión original este personaje contará con la voz de Nicolas Cage.
Oscar Isaac, que en la versión original pone voz a Miguel O'Hara, ya ha participado en otros filmes de Marvel. Él era Apocalipsis en X-Men: Apocalipsis (2016) y Marc Spector en la serie de televisión Caballero Luna.
La película original, Spider-Man: Un nuevo universo (2018), obtuvo el Oscar a Mejor película de animación.
Esta secuela la dirige Joaquim Dos Santos, todo un experto en la animación, que ha sido productor y director de las series animadas Voltron: El defensor legendario, La leyenda de Korra y Justice League Unlimited.
Otra de las nuevas incorporaciones será el Spider-Man 2099, a quien ya vimos en la escena poscréditos de Spider-Man: Un nuevo universo (2018).
Según han comentado en Twitter sus responsables, en el filme veremos al Spider-Man japonés, llamado Takuya Yamashiro, el protagonista de la serie de televisión de acción real de los años 70 de Japón.
Spider-Man: Un nuevo universo (2018) estaba dirigida por Bob Persichetti, Peter Ramsey y Rodney Rothman.