Lucy Lawless ('Xena, la princesa guerrera', 'Spartacus') fue elegida para interpretar a Shannon McMahon, un personaje que tendría mucha relevancia en la serie. Sin embargo, debido a un embarazo de riesgo, Lawless tuvo que abandonar el proyecto tras solo dos apariciones.
Cuando Gillian Anderson se quedó embarazada durante la grabación de la segunda temporada, muchos directivos pidieron que se eligiera a otra actriz para interpretar a Scully. Sin embargo, el productor Chris Carter se negó en redondo.
En su contrato, Gillian Anderson tenía prohibido interpretar a otros agentes del FBI que no fuera Dana Scully mientras durara 'Expediente X'. Esto le hizo perder la oportunidad de interpretar a Clarice Starling en 'Hannibal'.
En la serie, Mulder cree en todo lo relacionado con extraterrestres y fenómenos paranormales, mientras que Scully es una escéptica. En la vida real, al contrario, David Duchovny (Mulder) no creer en lo sobrenatural, a diferencia de Gillian Anderson (Scully).
En un episodio de 'Los Simpson' llamado "Expediente Springfield", Gillian Anderson (Scully) y David Duchovny (Mulder) participaron activamente parodiando a sus personajes de 'Expediente X'.